รหัสโครงการ: PHD61K0056ชื่อโครงการ: ระบาดวิทยาโมเลกุลและคุณลักษณะของเชื้อ Cryptococcus neoformans/ gattii species complex ในยุคก่อนการระบาดของเชื้อ HIVชื่อนักวิจัย: ดร. สุจิรพงษ์ ภาคจักษุ รองศาสตราจารย์ ดร. นายแพทย์พบชัย งามสกุลรุ่งโรจน์ระยะเวลาโครงการ: 2 ปีคำหลัก (key words) : คริปโตคอกโคซิส/ ยุคก่อนการระบาดเชื้อเอช ไอ วี/ ระบาดวิทยาโมเลกุล/ คุณลักษณะ บทคัดย่อการติดเชื้อคริปโตคอกคัสเป็นปัญหาสำคัญในทางสาธารณสุขของโลกตั้งแต่หลังการระบาดของเชื้อเอช ไอ วีหลังปี 1980 แม้ว่าการศึกษาทางระบาดวิทยาโมเลกุล และคุณสมบัติของเชื้อ Cryptococcus neoformans/gattii species complex ในยุคของการระบาดของเชื้อเอช ไอ วีจะมีการศึกษาอย่างแพร่หลายและต่อเนื่อง แต่กลับพบว่าข้อมูลในยุคก่อนหน้านั้นแทบไม่พบข้อมูลการศึกษาเลย ทางคณะผู้วิจัยจึงได้ออกแบบการศึกษาทางระบาดวิทยาโมเลกุลและคุณลักษณะของเชื้อ C. neoformans/gattii species complex ในยุคก่อนการระบาดของเชื้อเอช ไอ วีจำนวน 233 สายพันธุ์ โดยการศึกษาลักษณะทางจีโนทัยป์โดยวิธี URA5-RFLP, MLST และวิเคราะห์เพิ่มเติมด้วยวิธีการทางประชากรพันธุศาสตร์ สำหรับคุณลักษณะของเชื้อใช้วิธีการทดสอบปัจจัยความรุนแรงของเชื้อด้วยวิธีการในหลอดทดลองเพื่อดูการเจริญของเชื้อที่ 37 องศาเซลเซียส, การสร้างแคปซูล, การสร้างเอนไซม์ยูรีเอสและแลคเคส นอกจากนี้ยังทดสอบการไวต่อยาต้านเชื้อรา ได้แก่ แอมโฟเทอริซินบี, ฟลูไซโตซิน, ไอทราโคนาโซลและ ฟลูโคนาโซลร่วมด้วย ผลการศึกษาพบว่า 233 สายพันธุ์ของเชื้อประกอบด้วย C. neoformans 209 สายพันธุ์ และ C. gattii 24 สายพันธุ์ โดยส่วนใหญ่แยกได้จากผู้ป่วย (189, 81.1%) เมื่อทำการแยกด้วยจีโนทัยป์ด้วย URA5-RFLP พบว่าสายพันธุ์ส่วนใหญ่เป็น VNI (146, 62.7%) ใน C. neoformans และ VGIII (17, 7.3%) ใน C. gattii และวิเคราะห์ด้วย MLST พบ 47 sequence types ในการศึกษาครั้งนี้ โดย ST5/VNI (47, 23.0%) ใน C. neoformans และ ST75/VGIII (6, 25.0%) ใน C. gattii ที่น่าสนใจคือทางคณะผู้วิจัยพบสายพันธุ์ที่ไม่เคยพบมาก่อนในฐานข้อมูล คือ 1 ST ใน VNII และ 8 ST ใน VNIV เมื่อวิเคราะห์ด้วยวิธีการทางประชากรพันธุศาสตร์พบว่า VNIV มีความหลากหลายทางพันธุกรรมสูงที่สุด และลักษณะทางพันธุกรรมของสายพันธุ์ในสิ่งแวดล้อมมีความหลากหลายสูงที่สุด สำหรับแบบแผนความไวต่อยาต้านเชื้อราพบว่าความไวต่อยาฟลูโคนาโซลมีความเข้มข้นสูงที่สุด ส่วนยาไอทราโคนาโซลมีความเข้มข้นต่ำที่สุด เมื่อวิเคราะห์โดยใช้ความแตกต่างระหว่างจีโนทัยป์พบว่าแต่ละจีโนทัยป์มีแบบแผนความไวในแต่ละยาที่แตกต่างออกไปเป็นลักษณะเฉพาะ ที่น่าสนใจคือในการศึกษาเราพบว่ามีสายพันธุ์ของเชื้อราถึง 66.9% ที่มีความเข้มข้นที่สูงกว่าปกติที่ตอบสนองต่อยาแอมโฟเทอริซินบี จากผลการศึกษาข้างต้นทำให้เห็นว่ามีสายพันธุ์บางตัวที่หายไปหลังจากการระบาดของเชื้อเอช ไอ วี โดยสันนิษฐานได้จากการที่พบสายพันธุ์ใหม่ในการศึกษานี้ ยิ่งกว่านั้นเมื่อพิจารณาคุณลักษณะของเชื้อพบว่าเชื้อที่ก่อความรุนแรงในปัจจุบันแต่กลับ มีความรุนแรงที่ค่อนข้างน้อยเมื่อเปรียบเทียบกัน ในอนาคตการศึกษาลักษณะทางพันธุกรรมของเชื้อทั้งหมดนั้นควรทำร่วมเพื่อตอบคำถามเพิ่มขึ้นเกี่ยวกับความแตกต่างของเชื้อทั้ง 2 ช่วงเวลา<br><br>Project Code: PHD61K0056Project Title: Molecular Epidemiology and Characteristics of Cryptococcus neoformans/gattii Species Complex before HIV PandemicInvestigators: Sujiraphong Pharkjaksu, Ph.D. Assoc. Popchai Ngamskulrungroj, M.D., Ph.D.Project Duration: 2 yearsKeywords: Cryptococcosis/ Pre-HIV pandemic/ Molecular epidemiology/ CharacteristicsAbstractCryptococcosis has become a major global health problem since the advent of the HIV pandemic in the 1980s. Although the molecular epidemiology and characteristics of Cryptococcus neoformans/gattii species complex are well-defined depending on the isolates recovered, yet no epidemiological and characteristic data for the pre-HIV-pandemic era exists. A molecular epidemiological, in vitro virulence factors, and antifungal susceptibility study using 233 isolates of C. neoformans/gattii species complex isolated before 1975 were conducted. Genotypes were determined by URA5-RFLP and MLST and analyzed with population genetic analysis. Growth at 37?C, melanin synthesis, capsule production, and urease activity as virulence factors were quantified. Minimum inhibitory concentrations (MICs) to the important drugs for cryptococcosis?amphotericin B, 5-fluorocytosine, itraconazole, and fluconazole?were tested and compared the results with strain genotypes. The 233 Cryptococcus strains consisted of 89.7% (n = 209) C. neoformans and 10.3% (n = 24) C. gattii. Most were from clinical sources (189, 81.1%), and the major molecular type was VNI (146, 62.7%) in C. neoformans, and VGIII (17, 7.3%) in C. gattii. Among the 47 sequence types (STs) identified, one in VNII and 8 in VNIV were novel. ST5/VNI (47, 23.0%) in C. neoformans and ST75/VGIII (6, 25.0%) in C. gattii were the most common STs in the two species. Among C. neoformans, VNIV had the highest genetic diversity (Hd = 0.926) and minimum recombination events (Rm = 10), and clinical isolates had less genetic diversity (Hd = 0.866) than environmental (Hd = 0.889) and veterinary isolates (Hd = 0.900). Among C. gattii, VGI had a higher nucleotide diversity (? = 0.01436) than in VGIII (? = 0.00328). The high-virulence genotypes (ST5/VNI and VGIIIa/serotype B) did not produce higher levels of virulence factors than other genotypes. For antifungal susceptibility pattern, the highest geometric mean (GM) was observed for fluconazole (GM = 0.96 ?g/ml) while the lowest was for itraconazole (GM = 0.10 ?g/ml). MICs to fluconazole in C. gattii species complex were significantly higher than C. neoformans species complex (p < 0.001). Moreover, VNI strains showed significantly higher MICs than others such as VNII to fluconazole (p < 0.0001) and VNIV to amphotericin B (p = 0.022) and fluconazole (p = 0.008). In our collection, the high percentage (66.9%, 79/118 strains) of non-wild type clinical VNI strains, using AMB-ECV, was found. Moreover, 25 of 28 (89.3%) VNI strains from environmental and veterinary sources also had AMB-MICs above 0.5 ?g/ml. In general, there was no significant difference in GM AMB-MIC of the clinical strains isolated from patients with (35 patients) and without (78 patients) prior AMB treatment (0.85 vs 0.76; p = 0.624). GM MIC of the environmental strains were not significantly different from that of the prior AMB-treatment strains (0.98 vs 0.76, p = 0.159) and the post AMB-treatment strains (0.98 vs 0.85, p = 0.488). The Discovery of novel STs among the pre-HIV population suggests that they may either be selected out or disappeared during the HIV pandemic era. The virulence differences between the high- and low-virulence genotypes might not have evolved before the advent of the HIV pandemic. Whole-genome analysis and in vivo virulence studies would clarify the evolution of the genetic diversity and/or virulence during the pre- and post-HIV-pandemic eras. Moreover, the high rate of non-wild type among these otherwise naive isolates to amphotericin B is unexpected. Confirmation with more strains from a later era is needed.